对于广西无菌检验员培训学员来说，微生物限度检查方法适用性验证是绕不开的课题，亦是检验员应知应会事项，本文为大家介绍微生物限度检查方法适用性验证实操流程，一起看正文。

广西无菌检验员培训知识之微生物限度检查方法适用性验证实操流程

1.试验准备

（1）试验菌株（传代≤5 代，从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 代）：

计数法验证：金黄色葡萄球菌（CMCC (B) 26003）、大肠埃希菌（CMCC (B) 44102）、白色念珠菌（CMCC (F) 98001）、黑曲霉（CMCC (F) 98003）；

控制菌验证：按样品标准要求选择（如口服制剂选大肠埃希菌，外用药选金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）；

（2）培养基与试剂：胰酪大豆胨培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胆盐乳糖培养基等，需提前做适用性检查（促生长能力、抑制能力、指示特性达标）；

（3）仪器设备：生物安全柜（ISO5 级洁净环境）、恒温培养箱（精度 ±0.5℃）、薄膜过滤系统（滤膜孔径 0.45μm）、高压蒸汽灭菌器等，需经校准合格。

2.样品前处理（关键防干扰步骤）

（1）普通样品：

固体样品（片剂、中药材）：称取 10g 加 90mL pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液，均质制成 1:10 稀释液；

液体样品（口服液）：取 10mL 加 90mL 稀释液，制成 1:10 稀释液；

膏状样品（软膏）：取 10g 加含无菌吐温 80 的稀释液，40-45℃水浴分散后制成 1:10 稀释液；

（2）抑菌性样品（含防腐剂、抗生素等）：

稀释法：加大稀释倍数（如 1:1000）降低抑菌浓度；

中和法：针对性加入中和剂（青霉素酶中和青霉素，硫代硫酸钠中和含氯成分）；

薄膜过滤法：过滤后用 300-500mL 冲洗液分 3-5 次冲洗滤膜，去除残留抑菌成分。

3. 计数法验证操作

（1）菌液制备：将细菌接种于胰酪大豆胨培养基，30-35℃培养 18-24h；真菌接种于沙氏葡萄糖培养基，20-25℃培养 2-3 天，用稀释液制成 10-100CFU/mL 的菌悬液（室温 2h 内使用，2-8℃可保存 24h）；

（2）试验组：取 1mL 供试品稀释液 + 0.1mL 菌悬液，注入平皿或经薄膜过滤后接种培养基；

（3）对照组：取 1mL 稀释液 + 0.1mL 菌悬液，同条件培养；

（4）培养计数：细菌 30-35℃培养 48h，真菌 20-25℃培养 5-7 天，计算回收率并记录菌落形态。

4.控制菌检查法验证操作

（1）供试液制备：按样品标准要求制成适宜浓度供试液（如 1:10）；

（2）接种培养：取规定量供试液 + 不大于 100CFU 试验菌，接入增菌培养基（如大肠埃希菌用胆盐乳糖培养基），30-35℃培养 24-48h；

（3）分离鉴定：取增菌液划线接种于选择性培养基（如麦康凯琼脂），培养后观察可疑菌落，通过生化试验（如大肠埃希菌靛基质试验阳性）确认；

（4）对照设置：同时做阳性对照（仅加试验菌）和阴性对照（仅加稀释液），确保试验条件合规。

5.结果记录与判定

计数法：回收率、重复性、耐用性均符合标准，且阴性对照无菌生长，判定方法适用；

控制菌检查法：阳性对照检出目标菌，供试品组准确检出试验菌，阴性对照无菌生长，判定方法适用；未检出试验菌需重新优化前处理方法后验证。

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