2024年4月23日，国家药监局发布关于公开征求《人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册审查指导原则（2024年修订稿）（征求意见稿）》意见的通知,并面向公众公开征求意见。
人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册审查指导原则（2024年修订稿）（征求意见稿）
本指导原则旨在指导注册申请人对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。
本指导原则是针对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围
本指导原则适用于人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册申请和变更注册申请的情形。本指导原则针对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册申报资料中的部分内容进行撰写，其他未尽事宜应当符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》等相关法规要求。
本文所述人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂是指利用包括PCR-荧光探针法或其他分子生物学方法在内的核酸检测技术，以特定高危型HPV核酸（包括DNA和RNA）序列为检测目的，对人宫颈脱落上皮细胞进行体外定性检测的试剂，以确定受试样本中是否存在高于阳性判断值水平的高危型HPV病毒，或同时鉴定感染HPV的基因型别。此类试剂在临床上用于：（1）筛查宫颈细胞学检查为ASC-US（意义未确定的非典型鳞状上皮细胞）结果的患者，以确定是否需要进行阴道镜检查（以下简称ASC-US人群分流用途）；（2）对于30岁及以上的女性，通过检测是否有高危型HPV感染，与宫颈细胞学检查联合进行宫颈癌筛查，此检测结合细胞学病史和其他风险因素的评估、以及临床诊疗和筛查指南的要求，用于指导患者的管理(以下简称宫颈癌联合筛查用途)；（3）对于某年龄段（根据临床试验结果而定）女性，通过检测是否有高危型HPV感染，进行宫颈癌筛查，此检测结合细胞学病史和其他风险因素的评估、以及临床诊疗和筛查指南的要求，用于指导患者的管理（以下简称宫颈癌初筛用途）。除此以外，若申请人提出其他的预期用途，则应详细描述相关的临床背景信息和该检测与临床用途的相关性，并在临床试验中充分验证相关的临床意义。本指导原则仅针对上述三种预期用途提出相关要求。
这里所述的HPV核酸检测试剂是指可同时检测多种基因型HPV但不能对阳性结果进行基因分型的试剂，HPV基因分型试剂是指检测多种基因型HPV的同时可以对HPV阳性结果进行基因分型的试剂。
本指导原则适用的检测方法主要指基于核酸检测的分子生物学技术。现有HPV核酸检测技术主要包括杂交捕获法、酶切信号放大法、PCR-荧光探针法、转录介导的核酸扩增技术、PCR-杂交法以及高通量测序技术等。这些方法在性能评价上可能会略有差异，但在技术指标方面均适用于本指导原则，以下有关注册申报资料的要求主要针对PCR-荧光探针法提出，其他方法学试剂应针对产品自身特点进行相应补充或修正。
二、注册审查要点
（一）通用要求
关于本指导原则所述产品的预期用途还有以下几点需要强调。第一，在年龄＜30岁的女性中，虽然HPV感染率很高，但其自主清除率也很高，因此对于细胞学检查正常的受试者不建议再采用HPV检测做联合筛查，在经过临床试验证实的基础上亦可直接采用HPV检测作为初筛方法；此类HPV核酸检测试剂对不同年龄段人群的适用情况应符合相关宫颈癌筛查指南的要求。第二，HPV核酸检测试剂用于ASC-US人群分流或宫颈癌筛查时，其可覆盖的HPV基因型别应至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型（共14种），产品亦可同时包含26、53、73、82型中的一个或数个型别。根据现有的研究成果，若可检测的HPV基因型别不能涵盖上述14种高危型，则可能造成阴性预期值无法达到临床要求，因此不建议单独用于上述预期用途。对于基因分型试剂，目前的研究数据已证实16、18型的基因分型检测用于辅助（宫颈癌筛查中）HPV核酸检测阳性结果的分析，是有临床意义的，可以进行注册申请，申请人应合理陈述预期用途，其性能评估和临床试验中适用于本指导原则的部分应参照执行；但应注意：并非所有HPV基因型的分型检测均有确定的临床意义，如相关诊疗指南中明确除16、18型以外其他基因型分型具有明确的临床意义，则产品可以提供临床证据基础上，增加其他具有临床意义的基因型分型，而不应盲目扩大分型范围。第三，低危型HPV一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，但其检测的临床价值尚不明确，若申请人提出相关产品注册，则应详细解释其临床意义和适应证，并提供充分的临床证据。第四，鉴于此类试剂的样本采集方法不利于量值溯源，无法保证定量检测结果的准确性，因此建议检测试剂定位为定性检测，本指导原则不适用于进行定量或半定量HPV核酸检测试剂的注册；第五，根据目前相关诊疗指南要求，此类产品应采用宫颈采样刷进行样本采集。最后，本指导原则只针对与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌相关的高危型HPV检测，不适用于除宫颈样本外其他样本类型的检测。
（二）监管信息
1.产品名称及分类编码
产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》及相关法规的要求，如人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及16/18基因分型试剂盒(荧光PCR法)。根据《体外诊断试剂分类规则》，该产品按照第三类体外诊断试剂管理，分类编码为6840。
2.其他信息还包括产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录以及符合性声明等文件。
（三）综述资料
综述资料主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容。应详细说明产品所采用的技术原理及检测流程。与已上市同类产品进行比较，比较内容包括样本类型、检测原理、HPV基因型、检测靶基因、分析性能和临床性能等。
与预期用途相关的临床适应证背景情况应详述高危型HPV核酸检测和宫颈癌之间的相关性以及HPV检测临床应用的限定要求。
（四）非临床资料
1.产品技术要求及检验报告
注册申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据产品研制、前期评价等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献资料，结合产品特性按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求编写。该类产品作为第三类体外诊断试剂，应当以附录形式明确主要原材料以及生产工艺要求。
人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂已有国家参考品，技术要求中应体现国家参考品的相关要求，并使用国家参考品对三批产品进行检验。
产品技术要求的相关要求应不低于适用的国家标准品、行业标准相应的要求。
2.分析性能研究
注册申请人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行所有分析性能研究，提交具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等详细资料。
如申报产品适用不同的机型，需要提交在不同机型上进行性能评估的研究资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格间的差异进行分析或验证。对于适用的不同样本类型应分别进行分析性能研究。
分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、阴阳性鉴定及浓度等。研究中采用的HPV阳性样本，应采用合理方法确定其阴阳性和浓度水平，并提交具体的试验资料。样本的核酸性质（DNA或RNA）应与产品检测的靶核酸一致。鉴于HPV病毒尚不能体外培养，可采用临床样本或感染HPV的细胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因组DNA（或转录RNA）等。对于各项性能中采用的样本，在下述各项性能研究资料中分别提供样本信息列表。检出限和包容性研究中所用样本应相互独立。
申请人应对不同的样本保存液分别完成性能评估，包括最低检测限和精密度评价等，证明不同的样本保存液不会影响试剂的分析性能。
2.1样本稳定性
包括采集后未经处理的样本，加入不同样本保存液的样本，研究内容包括冷藏保存时间，冷冻保存时间，冻融次数等。
如样本收集后可不立即进行检测，还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。
2.2适用的样本类型
列明产品适用的样本类型。
2.3准确度
根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。
2.4精密度
应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价，例如：为期至少20天的检测，具体方案可参考性能评价相关文件进行。
精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。鉴于模拟样本并不能体现临床样本可能带来的所有变异因素，因此精密度评价中应同时包含若干临床样本。临床样本至少包含16/18型，每一次检测均应从核酸提取开始。模拟样本应针对检测范围内的全部HPV基因型别分别设置。
用于精密度评价的模拟样本和临床样本均应至少包含3个水平：阴性样本、检出限水平样本、中/强阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求，例如：
阴性样本：不含待测物或待测物浓度为零时，阴性符合率应为100%（n≥20）。
检出限水平样本：检出限水平样本阳性检出率应≥95%（n≥20）。
中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性符合率为100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。
2.5检出限
建议采用梯度稀释的方式进行检出限的确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份稀释液重复检测不少于20次，将具有95%阳性检出率的病毒水平作为检出限。
应对申报产品声称可检测的HPV基因型分别进行研究。应提供检出限研究用样本的来源、型别确认及病毒核酸浓度的确定方法及验证结果。可以copies/mL作为病毒核酸浓度的表示方式。
2.6分析特异性
2.6.1交叉反应
应针对预期用途不包含的其他HPV基因型，可在人类泌尿、生殖道寄生微生物，经性传播的其他病原体，其他常见病原体等进行交叉反应验证。用于交叉反应验证的样本，除HPV外的其他病原体应尽量采用灭活病原体培养物或临床样本。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常细菌感染的水平为106 CFU/mL或更高，病毒为105 PFU/mL或更高。
首先，应在HPV病毒不同基因型间进行交叉反应验证；其次，采用其他的病原微生物进行验证（见附表1）。
应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中体现。
此外，应针对被检测靶序列与人基因组及可能存在于人类泌尿、生殖道的微生物基因组进行基因序列比对，并提交比对结果，如有同源性序列则应进行交叉反应验证。
2.6.2干扰物质
应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价，并针对有代表性的HPV基因型（如16、18型），至少在HPV临界阳性水平进行干扰试验验证。干扰物质的选取应至少包括：血红蛋白、白细胞、宫颈粘液、阴道避孕药物、女性卫生用品、阴道用抗真菌药物、阴道润滑剂等。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的 Ct 值差异。
2.7核酸提取/纯化性能
在进行核酸检测之前，建议有核酸（DNA或RNA）提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。对配合使用的所有核酸提取试剂进行提取核酸纯度、浓度、提取效率的研究，必要时可考虑与质量较好的核酸提取试剂进行平行比对。若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂进行抗干扰、精密度和检出限的验证。
2.8反应体系
2.8.1样本采集和处理
详述样本保存液、样本处理方式的选择和设置，提供相关的研究资料。如涉及不同的样本处理方式需进行检测结果一致性的评价。
2.8.2核酸提取和反应体系
研究确定最佳核酸提取和反应体系，包括核酸提取用的样本体积、洗脱体积和PCR加样体积、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。
提交不同适用机型基线和阈值循环数的确定资料。
不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。
3.稳定性研究
申报试剂的稳定性主要包括实时稳定性、运输稳定性、开瓶稳定性、使用稳定性及冻融次数限制（如涉及）等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
4.阳性判断值研究
对于此类试剂，阳性判断值即为能够获得理想的临床灵敏度和临床特异性的临界值（Cut-off），例如对于荧光PCR法即为Ct值的确定资料，对于PCR-点杂交法即为最低检测限（LoD）。
样本来源应具有多样性和代表性，考虑不同年龄、地域、不同时间和感染阶段等因素，尽量纳入含有干扰物质或其他易引起交叉反应病原体的样本。建议采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式进行研究；如采用其他方法进行研究，应说明这种方法的合理性。如结果存在灰区，应提供灰区的确认资料。同时提供内标值确定的研究资料。推荐申请人充分考虑产品用于联合筛查或初筛的性能，确定相应的阳性判断值。
提交阳性判断值研究所用样本的背景信息列表，至少包括样本来源机构、性别、年龄、临床诊断信息、检测结果等。
5.其他资料
5.1主要原材料研究资料
此类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）、质控品及企业参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备及质量标准等的研究资料、质控品的定值试验资料等。
5.1.1引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对所有预期适用的HPV基因型别进行检出能力和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳组合，并提交筛选的研究数据。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性试验等。
5.1.2酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其质量标准应包括DNA聚合酶活性、核酸内切酶活性、热启动能力（如适用）、热稳定性等；还可能涉及尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）和逆转录酶，亦应分别对其酶活性等进行评价和验证。
5.1.3脱氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，应提供其纯度、浓度、功能性等验证资料。
5.1.4质控品（对照品）
试剂盒一般包含阴性质控品和阳性质控品。阳性质控品的核酸性质应与待测样本的靶核酸性质一致，如同为DNA或RNA，其中可不包含所有涉及的HPV基因型，但应选择临床较常见的或风险程度较高的基因型，至少包含16或18型。阳性质控品和阴性质控品需参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程，以对整个提取和PCR扩增过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。应对阳性的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求。提交质控品的原料选择、制备、定值等的试验资料。
5.1.5内标
内标（内对照）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸共同提取及扩增。需对内标的引物、探针设计和相关反应体系的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。明确内标的检测结果范围。
5.1.6企业参考品
该类产品的企业参考品一般包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品和重复性参考品。企业参考品的核酸性质（DNA或RNA）应与产品检测的靶核酸一致，可采用感染HPV的细胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因组DNA（或转录RNA）等。
应提交企业参考品的原料来源、选择、制备、阴阳性及浓度确认等试验资料。企业参考品的设置建议如下：
阳性参考品：无论试剂盒能否进行HPV基因分型，均应针对检测范围内的全部HPV基因型分别设置。
阴性参考品：主要涉及对交叉反应的验证，适当纳入其他HPV基因型样本和其他生殖道病原体样本。
检测限参考品：可采用检出限或略高于检出限的浓度水平，应针对检测范围内的不同基因型分别设置。
精密度参考品：至少设置弱阳性的浓度水平。应选择临床较常见的或风险程度较高的基因型（至少包含16或18型）且包含每个反应管的代表性基因型，可不包含检测范围内的全部HPV基因型。
5.2生产工艺研究资料
介绍产品主要生产工艺，可用流程图结合文字的方式表述。提交主要生产工艺的确定及优化研究资料。
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